亨廷頓相關蛋白40過度表現對於細胞自噬的影響

Abstract

亨廷頓舞蹈症為顯性遺傳的神經退化性疾病，致病原因為亨廷頓蛋白基因發生突變，導致突變型亨廷頓蛋白具有過度擴張的多聚麩醯胺，為錯誤折疊的蛋白質易形成聚集體並堆積在神經細胞中。亨廷頓蛋白與多種蛋白質交互作用以參與細胞內的調控，其中亨廷頓蛋白與亨廷頓相關蛋白40結合，可調節早期內噬體的運輸。在患者腦部發現亨廷頓相關蛋白40大量表現，其與微管有交互作用，並與促進突變型亨廷頓蛋白聚集體形成有關。細胞內的清除機制能夠將異常的蛋白質降解以維持細胞恆定，包含泛素-蛋白?體與細胞自噬，其中泛素-蛋白?體的組成份子可能被滯留於聚集體，因此細胞自噬的進行顯得十分關鍵，故探討亨廷頓相關蛋白40過度表現對細胞自噬的影響。結果發現亨廷頓相關蛋白40過度表現會促進細胞自噬的進行，進一步發現其作用機制為mTOR-independent，且受到PI-3 kinase的抑制影響。目前對亨廷頓相關蛋白40的研究有限，若能知其在細胞內的分布，將有助於其?能之定位，由於市售HAP40抗體(Millipore AB5872 a a 314-325)偵測效果不佳，因此先前製作了兩支HAP40抗體。使用這三種抗體進行特性分析，發現HAP40 (LTK a a 293-310)、HAP40 (LTK a a 29-47)的偵測較符合HAP40的實際分子量，且knockdown後能偵測到亨廷頓相關蛋白40表現量降低，而市售的HAP40 (Millipore AB5872 a a 314-325)抗體則否；另外為了明瞭HAP40分布在細胞核或細胞質，以生化分餾分析，發現亨廷頓相關蛋白40存在於細胞質。在神經細胞中，囊泡藉由運動蛋白在軸突的微管上得以運輸，由驅動蛋白負責正向運輸及動力蛋白負責反向運輸，已知突變型亨廷頓蛋白聚集體內包含運動蛋白，使細胞中游離的運動蛋白減少，影響物質運送。當動力蛋白?能受抑制時，會造成聚集體的堆積，因此想了解驅動蛋白是否也有類似情形。實驗上針對驅動蛋白輕鏈的兩種異構型：KLC1和KLC2進行knockdown，因為輕鏈能夠與物質結合並調控驅動蛋白的活性。結果發現KLC1和KLC2受到抑制時，突變型亨廷頓蛋白聚集體有明顯增加的現象。綜合以上結果顯示亨廷頓相關蛋白40過度表現會促進細胞自噬的進行，其機制為mTOR- independent，且受到PI-3 kinase的抑制所影響；其次分析不同HAP40抗體特性，發現LTK的兩株抗體能夠偵測到內生性HAP40，而由生化分餾結果得知HAP40存在於細胞質；另外KLC1和KLC2表現量下降會導致突變型亨廷頓蛋白聚集體數目增加。

Date of Award	2014 Feb 10
Original language	Chinese
Supervisor	Lu-Shiun Her (Supervisor)