亨廷頓相關蛋白40過度表現對於細胞自噬的影響

Translated title of the thesis: Effects of HAP40 overexpression on autophagy
  • 黃 良卿

Student thesis: Master's Thesis

Abstract

亨廷頓舞蹈症為顯性遺傳的神經退化性疾病,致病原因為亨廷頓蛋白基因發生突變,導致突變型亨廷頓蛋白具有過度擴張的多聚麩醯胺,為錯誤折疊的蛋白質易形成聚集體並堆積在神經細胞中。亨廷頓蛋白與多種蛋白質交互作用以參與細胞內的調控,其中亨廷頓蛋白與亨廷頓相關蛋白40結合,可調節早期內噬體的運輸。在患者腦部發現亨廷頓相關蛋白40大量表現,其與微管有交互作用,並與促進突變型亨廷頓蛋白聚集體形成有關。細胞內的清除機制能夠將異常的蛋白質降解以維持細胞恆定,包含泛素-蛋白?體與細胞自噬,其中泛素-蛋白?體的組成份子可能被滯留於聚集體,因此細胞自噬的進行顯得十分關鍵,故探討亨廷頓相關蛋白40過度表現對細胞自噬的影響。結果發現亨廷頓相關蛋白40過度表現會促進細胞自噬的進行,進一步發現其作用機制為mTOR-independent,且受到PI-3 kinase的抑制影響。目前對亨廷頓相關蛋白40的研究有限,若能知其在細胞內的分布,將有助於其?能之定位,由於市售HAP40抗體(Millipore AB5872 a a 314-325)偵測效果不佳,因此先前製作了兩支HAP40抗體。使用這三種抗體進行特性分析,發現HAP40 (LTK a a 293-310)、HAP40 (LTK a a 29-47)的偵測較符合HAP40的實際分子量,且knockdown後能偵測到亨廷頓相關蛋白40表現量降低,而市售的HAP40 (Millipore AB5872 a a 314-325)抗體則否;另外為了明瞭HAP40分布在細胞核或細胞質,以生化分餾分析,發現亨廷頓相關蛋白40存在於細胞質。在神經細胞中,囊泡藉由運動蛋白在軸突的微管上得以運輸,由驅動蛋白負責正向運輸及動力蛋白負責反向運輸,已知突變型亨廷頓蛋白聚集體內包含運動蛋白,使細胞中游離的運動蛋白減少,影響物質運送。當動力蛋白?能受抑制時,會造成聚集體的堆積,因此想了解驅動蛋白是否也有類似情形。實驗上針對驅動蛋白輕鏈的兩種異構型:KLC1和KLC2進行knockdown,因為輕鏈能夠與物質結合並調控驅動蛋白的活性。結果發現KLC1和KLC2受到抑制時,突變型亨廷頓蛋白聚集體有明顯增加的現象。綜合以上結果顯示亨廷頓相關蛋白40過度表現會促進細胞自噬的進行,其機制為mTOR- independent,且受到PI-3 kinase的抑制所影響;其次分析不同HAP40抗體特性,發現LTK的兩株抗體能夠偵測到內生性HAP40,而由生化分餾結果得知HAP40存在於細胞質;另外KLC1和KLC2表現量下降會導致突變型亨廷頓蛋白聚集體數目增加。
Date of Award2014 Feb 10
Original languageChinese
SupervisorLu-Shiun Her (Supervisor)

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亨廷頓相關蛋白40過度表現對於細胞自噬的影響
良卿, 黃. (Author). 2014 Feb 10

Student thesis: Master's Thesis