利用胜?水平親和性純化富集策略鑑定雌激素化核蛋白

Translated title of the thesis: Peptide-Level Affinity Enrichment for the Identification of Nuclear Protein Targets of Catechol Estrogens
  • 劉 奕辰

Student thesis: Master's Thesis

Abstract

雌激素與細胞內蛋白質共價結合會導致?能失常,若其代謝物與 DNA 鍵結成加成物更會提高罹癌的風險,因此研究雌激素化蛋白質是刻不容緩的!近年研究發現,雌激素於人類胰島素上的修飾會影響其訊號傳輸、於人類血清白蛋白上的修飾會影響其抗氧化及運輸物質的?能。雌激素化修飾的重要性已明確可知,但礙於其修飾微小,因此就算以靈敏度極高的質譜儀也難以偵測到真實樣品中所有的雌激素化蛋白,特別是低含量的蛋白,因此需要純化策略,排除真實樣品中的干擾物質與基質,只針對雌激素化的蛋白做鑑定。 在此,實驗室開發出一套純化富集系統,先利用鍵擊化學-疊氮基與炔類環化加成反應,穩定得結合含有雙硫鍵裂解點的生物素化學探針與雌激素代謝物,搭配目前已知最強非共價鍵鍵結-生物素與鏈親合素的親和力,將非雌激素的蛋白清洗掉且去除真實樣品的干擾物質,進而達到純化富集的效果。最後再搭配雙甲基標定法以 D/H 比值判斷其可信度,已成?從肝臟組織中鑑定出 374 個極可能被雌激素修飾的蛋白,其中有?多影響細胞內氧化還原能力的酵素。 然而,還有?多非雌激素化的蛋白與干擾物質尚未去除,因此衍伸出了改良的純化富集系統。原先的純化策略在鏈親合素鍵結步驟後,接著切斷生物素探針上的雙硫鍵裂解點,使抓住的雌激素化蛋白沖堤收集起來並接著做酵素水解。然而得到的產物也會包含?多非雌激素鍵結的胜?片段,因此新的純化策略在鏈親合素鍵結步驟後,接著使用兩種酵素做水解,並去除大多數非雌激素化修飾的胜?片段,再將雌激素化胜?沖堤下來,達到更好的富集效果,提供了更多雌激素化修飾的片段,且提高可信度與一次質譜的訊號強度及清晰的二次質譜圖。 將改良的純化系統,應用在細胞核蛋白的純化,鑑定到了108個蛋白,含有73個蛋白有雌激素修飾,有7個極可信的雌激素修飾核蛋白。其中含有組蛋白甲基轉移?(Histone methyltransferase),此酵素會影響組蛋白上甲基化修飾的程度,影響片段基因的表現與否。可望對轉譯後修飾與組蛋白上的雌激素位點,有更加深入的了解,藉此提供生物醫學科學家更多訊息。
Date of Award2018 Sept 4
Original languageChinese
SupervisorShu-Hui Chen (Supervisor)

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