探討環境因子對大腸桿菌活著非可培養生理狀態之影響

Translated title of the thesis: The effects of environmental factors on the viable but nonculturable state in Escherichia coli
  • 徐 昀劭

Student thesis: Master's Thesis

Abstract

活著非可培養 (Viable but nonculturable state VBNC)是大腸桿菌(Escherichia coli)在生存受到環境壓力時的一種生理表現。在VBNC狀態下,大腸桿菌能維持基本代謝能力,但無法在固態培養基上生長,但以環保署公告之培養法計數水樣中大腸桿菌數量時力有未逮,因此以可培養大腸桿菌數量作為指標可能誤導水質安全的判斷。在環境壓力消失,或提供營養生長環境,這些大腸桿菌會回復正常生長代謝的生態狀態,目前為止尚無合適的VBNC大腸桿菌細胞的定量分析方法。本研究的目的是建立一套研究VBNC大腸桿菌的方法,並探討環境因子如溫度、鹽度影響大腸桿菌進入到VBNC的程度。 本研究利用培養法分析可培養細胞數量(Culturable cell number),碘化丙啶即時定量聚合?(PMA-qPCR)法分析活菌細胞數量(Viable cell number),即時定量聚合?(qPCR)法分析總菌細胞數量(Total cell number),三種方法分析同一樣本的結果可以求得活著非可培養細胞數(VBNC cell number)與死菌細胞數(Dead cell number)。本研究以純菌培養試驗探討在對數生長期、靜止期及死亡期狀態大腸桿菌細胞的可培養率、VBNC細胞比率與死亡細胞比率。結果顯示大腸桿菌在對數生長期、靜止期、及死亡期時可培養細胞分別佔總細胞數量的65%、35%及0 7%,表示大腸桿菌的可培養率由對數生長期遞減至死亡期。根據VBNC細胞比率的數據,大腸桿菌在對數生長期、靜止期及死亡期的VBNC細胞分別為總細胞數量的13 1%、37 8%及63 9%,表示大腸桿菌細胞生理狀態隨著對數生長期進入到死亡期的過程VBNC表現情形逐漸遞增。由死亡細胞率的數據分析得知,大腸桿菌在對數生長期與靜止期時的死亡細胞的比率大約為21 6-27 3%;然而在死亡期時此數值稍稍升高至35 4%,死亡細胞的數量隨著大腸桿菌由對數生長期進入到死亡期逐漸遞增,但上升趨勢比可培養或VBNC細胞不明顯。 以純菌培養試驗探討大腸桿菌可培養細胞、活著非可培養細胞及與死亡細胞在不同溫度與氯化鈉(NaCl)濃度的衰亡速率,隨著溫度從4oC上升至50oC,可培養的細胞的衰亡速率由-0 11 day-1增加至-4 77 day-1(p value = 0 0002),活著非可培養細胞的衰亡速率由-0 00077 day-1增加至0 12 day-1(p value = 0 53),死亡細胞的衰亡速率由-0 023 day-1增加至-0 025 day-1( p value = 0 66),由上述結果表示溫度對於可培養的大腸桿菌的衰亡速率有顯著影響,然而溫度對於活著非可培養與死亡細胞衰亡速率無顯著影響(p value > 0 1)。另一方面,氯化鈉濃度由0?上升至70?,大腸桿菌可培養細胞的衰亡速率由-0 45 day-1增加至-0 67 day-1( p value = 0 00002),大腸桿菌活著非可培養細胞的衰亡速率由-0 17 day-1增加至-0 28 day-1( p value = 0 006),大腸桿菌死亡細胞的衰亡速率由-0 11 day-1增加至-0 22 day-1( p value = 0 62),由上述結果表示鹽度對於大腸桿菌可培養細胞與活著非可培養細胞有顯著性影響,其對可培養細胞影響更為顯著,比較於溫度與鹽度的結果,大腸桿菌可培養細胞的衰亡速率受到溫度的影響程度較大。 最後,本研究探討在水庫、河川與生活汙水中的大腸桿菌細胞的非可培養率,結果顯示在水庫中當可培養大腸桿菌濃度為100 CFU/100mL時,非可培養率為97%;濃度101 CFU/100mL時,非可培養率為83%;濃度為102 CFU/100mL時,非可培養率為90%。在河川中,當可培養大腸桿菌濃度為102 CFU/100mL時,非可培養率為67%;濃度103 CFU/100mL時,非可培養率為52%;濃度為104 CFU/100mL時,非可培養率為49%,其河川樣本的非可培養率皆低於水庫樣本,且在河川中非可培養率隨著大腸桿菌的濃度升高而降低。在汙水廠中,當可培養大腸桿菌濃度為106CFU/100mL與107CFU/100mL時,非可培養率皆為29%。表示污染程度可能會影響大腸桿菌進入到VBNC狀態。本研究發現2012年7月新店溪蘭溪流域的匯流井下游因受到化糞池溢流汙染造成大腸桿菌濃度升高,且100%的大腸桿菌細胞處於可培養的生理狀態,經邊坡截流工程改善後,在2013年1月21日採樣分析結果顯示大腸桿菌的濃度降低10倍左右,且細胞可培養率亦下降至50%,已接近新店溪流域其他水樣的分析數據。此結果說明分析大腸桿菌細胞的可培養率可作為糞便汙染來源追蹤的指標。 本研究建立了一套定量大腸桿菌VBNC細胞的方法,成?地分別定量活著的、非可培養的及死亡的細胞,分析結果顯示在不同的環境因子下,影響大腸桿菌進入到VBNC狀態的程度不同,此方法亦可應用於其他水質指標菌、病原菌、及其他環境微生物的相關研究。
Date of Award2014 Aug 27
Original languageChinese
SupervisorJer-Horng Wu (Supervisor)

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