於希瓦氏菌中建立重組蛋白表達系統

Translated title of the thesis: Establish recombinant protein expression system by Shewanella oneidensis MR-1
  • 易 盈甄

Student thesis: Master's Thesis

Abstract

希瓦氏菌 MR-1 為一格蘭氏兼性厭氧菌,因具有特殊的電子傳遞通道,能有效進行電子傳遞、金屬還原及偶氮化合物的降解,因此被廣泛應用於生物復育、微生物燃料電池及污水整治中。此菌株亦可於體內生產結構較複雜的細胞色素 c蛋白質,使其可作為特定蛋白質之表達宿主。本研究即基於希瓦氏菌之特殊性質,欲建立有效應的重組蛋白表達系統,藉此提升目標蛋白質的表達量,並改善其催化效率或增加高經濟價值化合物之產量,達成希瓦氏菌於工業應用的可行性。 本研究分別建立自發型與誘導型表達系統:自發型表達系統含有不同啟動子 (PLacI,PJ23100,PJ23105,PJ23109,PTet) 及複製原點 (pBR322及p15A),並表達綠色螢光蛋白比較其產量,其中以 PLacI 啟動子與高拷貝數之 pBR322 複製原點具有最高螢光強度,達5950 a u 。結果顯示啟動子與複製原點於希瓦氏菌對蛋白質表達的影響趨勢與大腸桿菌相同,但大腸桿菌常用之複製原點於 MR-1 內的複製量約為四分之一,MR-1中拷貝數分別是 p15A 的 34 9 及 pBR322 的 72 5。本研究首次整合T7 RNA 聚合?至 MR-1 基因組,並構築 p28m 載體使質體含有 T7 啟動子,經由接合作用轉化至 MR-1達成T7誘導表達系統。由偶氮還原?、紅色螢光蛋白及碳酸酐?證實其可行性及蛋白質之?能與活性,其中RFP之螢光強度為原型菌株之 8 倍;含CA之菌株對於二氧化碳轉換活性最高可達 12106 WAU/mg,相較於原型菌株其效率皆有顯著提升。由以上結果可知,T7 表達系統可順利於希瓦氏菌運作,提升了蛋白質表達量及菌株的應用效率。 自發型表達系統後續應用於表達 Mtr 通道蛋白欲提升其電子傳遞效率,然後結果發現表達通道上單一蛋白反而會導致偶氮染料降解能力下降,甚至缺陷,因此對於 Mtr 通道蛋白的調控仍需更深入研究及複雜的調控方式。T7 表達系統則應用提升血基質合成途徑上之 Heme 蛋白,目標提升五胺基酮戊酸 (ALA) 之產量。結果發現於 24 小時 HemD、HemF 及 RsHemA 分別提升 ALA產量至2 16倍、1 13倍及1 33倍,但隨時間增加而下降,經由 qPCR 分析質體並未發現質體丟失,ALA生產不穩定性後續仍須探討及改善。綜合上述二類表達系統,本研究已成?建立了希瓦氏菌重組蛋白表達系統,後續將配合基因調控開拓更廣泛的應用。
Date of Award2018 Aug 8
Original languageChinese
SupervisorI-Son Ng (Supervisor)

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於希瓦氏菌中建立重組蛋白表達系統
盈甄, 易. (Author). 2018 Aug 8

Student thesis: Master's Thesis