於體外試驗及原部位腫瘤小鼠模式中合併新穎組織蛋白去乙醯?抑制劑協同增強etoposide對乳癌細胞之毒殺能力

Translated title of the thesis: A novel histone deacetylase inhibitor synergistically enhances etoposide cytotoxicity in breast cancer cells in vitro and in an orthotopic mouse model
  • 洪 奇薇

Student thesis: Master's Thesis

Abstract

乳癌是現代婦女最常見的癌症,也是癌症死亡的第二大原因,過去十年,雖然乳癌的死亡率逐漸下降,但發病率正逐漸增加,目前能透過外科手術、放射治療、藥物治療、免疫治療等方式治療乳癌,但臨床上的一些化療藥物常伴隨著副作用的產生,像是噁心、體重下降、掉髮、白血球及血小板數過低等,另外也需解決三重陰性乳癌對傳統藥物治療效果較差的情形,因此我們仍需要新穎且更有效的治療策略,使病人在較低的負擔下達到更好的療效,其中合併治療能透過化療藥物間不同的分子機制,增加細胞毒殺效果、降低抗藥性、並使重疊的毒性最小化。Etoposide是typeⅡ的拓撲異構?抑制劑,會使癌細胞產生DNA錯誤,造成DNA雙股斷裂並且誘發細胞凋亡,另外組織蛋白去乙醯?抑制劑(HDACi)則被發現會抑制DNA修復並誘發細胞凋亡,但HDACi抑制DNA修復的分子機制目前尚有待釐清。因此我們利用體外試驗以及原部位乳癌動物模式,探討新的HDACi YCW-3合併處理etoposide是否對乳癌細胞具有協同毒殺效果,並了解是否與HDACi抑制DNA的修復有關,並進一步探討HDACi抑制DNA的修復是否為透過調控蛋白質泛素化的結果。在體外試驗方面,分別以etoposide和YCW-3單獨與合併處理小鼠三重陰性乳腺癌細胞株4T1,以MTT assay分析細胞毒殺效果;利用流式細胞儀測定細胞死亡模式;透過彗星試驗及西方墨點法分析DNA之損傷與修復;另外使用免疫沉澱觀察蛋白的泛素化及蛋白之間的交互作用;mRNA的表現程度則透過即時聚合?鏈式反應分析。在動物試驗方面,建立原部位乳癌動物模式,並利用活體影像系統監測腫瘤的生長,犧牲後取出腫瘤利用免疫組織化學染色及西方墨點法分析相關蛋白的表現量變化。本研究首先比較了YCW-3與傳統組織蛋白去乙醯?抑制劑SAHA,發現YCW-3在藥物動力學、組織蛋白去乙醯?抑制能力及細胞毒殺效果方面皆優於傳統藥物,表示YCW-3具有發展的潛力。於細胞及動物實驗中,相較於單獨處理組別,合併處理YCW-3與etoposide能協同增強細胞毒殺效果並有效抑制腫瘤生長。為釐清協同作用的機制,首先利用彗星試驗發現藥物合併處理組別比單獨處理產生更嚴重的DNA損傷,且DNA損傷指標蛋白γH2AX的表現量於合併處理的組別也有明顯的增加。而在處理YCW-3的組別中發現DNA關鍵修復蛋白DNA-PK的表現量會受到抑制;透過即時聚合?鏈鎖反應分析,得知處理YCW-3細胞中DNA-PK mRNA表現程度並無顯著差異。而透過處理MG132能夠恢復YCW-3抑制的DN-PK表現量,表示DNA-PK蛋白的抑制是透過泛素-蛋白?體路徑所降解;進一步利用免疫沉澱法發現YCW-3會促進DNA-PK與其E3連接?RNF144A之間的交互作用,並誘發DNA-PK蛋白的泛素化,最後使DNA-PK受到蛋白?體降解。於細胞死亡模式的研究結果中也發現合併處理的組別會顯著增加細胞凋亡和細胞自噬的百分比,並且細胞自噬是扮演促進死亡的角色。綜合以上結果得知,合併處理YCW-3可經由調控修復蛋白泛素化以抑制DNA修復,增加etoposide對於乳癌細胞之抗癌效果。
Date of Award2015 Feb 13
Original languageChinese
SupervisorYing-Jan Wang (Supervisor)

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