蝴蝶蘭藍光接受子Phototropin基因的選殖與其特性分析

Abstract

Phototropins是藍光接受器，在葉綠體移動、氣孔打開及植物的生長及發育扮演著重要的角色。由於植物不能移動，在高光照環境下透過葉綠體躲避可減少光抑制之傷害。然而，在低光照環境下為了增加光合作用效率，植物會累積較多的葉綠體於細胞表面。在台灣蝴蝶蘭是一種很重要的經濟花卉作物。然而屆至目前為止，尚無對蝴蝶蘭葉綠體移動的研究。故本論文由三個方向做有系統的探勘: 1)選殖蝴蝶蘭兩個 Phototropins (簡稱: PaPhot1 及 PaPhot2)全長序列; 2) 探討Phototropins 對於光線的反應及葉綠體移動進行生理研究;及3) 確認蝴蝶蘭 Phototropins 的基因?能。首先我們利用 5’RACE 以及3’RACE (rapid amplification of cDNA end cDNA末端快速擴增) 技術選殖 PaPhot1 及 PaPhot2 的全長 cDNA 序列，獲得基因全長分別為 3448 bp 以及 4954 bp。蝴蝶蘭 Phototropins 胺基酸序列與阿拉伯芥相似，具有兩個 LOV 重要區域及一個 Ser/Thr kinase 區域。親緣演化分析發現PaPhot1 及 PaPhot2 與單子葉植物親緣關係較相近。蝴蝶蘭葉片經由不同光源及不同藍光強度照射處理後分析PaPhot1 及 PaPhot2 在不同光源下皆有表現，但在藍光下表現特別高。在持續的黑暗環境下，蝴蝶蘭 PaPhots 在第四天有較多的表現，但在一週後其表現量則開始降低。經由不同藍光強度檢測顯示，在藍光20 μmole m-2 s-1 下蝴蝶蘭的葉綠體不移動，然而藍光低於15 μmole m-2 s-1 時葉綠體會累積至平週細胞壁。藍光高於25 μmole m-2 s-1 葉綠體會躲避至背斜細胞壁，特別是藍光高於100 μmole m-2 s-1 時葉綠體有明顯地躲避作用。PaPhots 在低藍光下表現量皆有上升，然而在高藍光下只有 PaPhot2 有較高的表現。自然界中蝴蝶蘭為附生的習性，在蝴蝶蘭根部發現 PaPhot1 及 PaPhot2 是有表現。此外相較於較年輕的根部部位，成熟的根部含有較多的葉綠素以及表現較多的 Phototropins。原位雜交技術顯示在根冠、葉片表皮及維管束有表達 PaPhot1 及 PaPhot2。為了確認Phototropins 參與葉綠體移動的生物?能，本研究利用病毒誘導基因靜默 (virus induced gene silencing VIGS) 技術指出，蝴蝶蘭VIGS的葉子PaPhots 基因表現量減少且葉綠體移動的能力也跟著減低。此外，我們也利用互補實驗過度表達外源 PaPhot1 及 PaPhot2 於阿拉伯芥突變株中， RT-PCR 確認AtPhot1 及 AtPhot2 基因在突變株中已被剔除。結果顯示PaPhots基因過度表達於阿拉伯芥轉殖植株中有表現且恢復了葉綠體移動的能力。綜合以上結果，本研究成?地選殖蝴蝶蘭中的 Phototropins 基因，對該基因的特性有更多的瞭解，且證實他們的生物?能為藍光接受器。

Date of Award	2014 Sept 2
Original language	Chinese
Supervisor	Wen-Chi Chang (Supervisor)