針對癌症治療發展對於整合蛋白?vβ3和/或?5β1具有選擇性和親和力的去整合蛋白

Abstract

整合蛋白(integrin)是一群由?和β兩個次單元所組成的異質雙體，其參與?多細胞過程。整合蛋白的配體在與其相互結合時，RGD、NGR和LDV這些胺基酸序列是主要的辨認位置。在含有RGD序列的配體中，其RGD序列周遭區域、協同區域和C端區域可以調節對整合蛋白結合的親和力與專一性。在第一型纖維連結蛋白(fibronectin)之第五(Fn-I5)和第七(Fn-I7)模組中，NGR序列可與整合蛋白?5β1結合，且其自發性去胺基作用會產生isoDGR序列，進而成為一個可以與整合蛋白?vβ3結合的序列，並且在調控纖維連結蛋白的纖維組裝，及調控內皮細胞的黏著和增生都扮演重要的角色。在我的研究中使用含有RGD序列的去整合蛋白，馬來腹蛇的蛇毒蛋白(Rhodostomin，Rho)為一個骨架去探討在去整合蛋白中可能與整合蛋白作用的區域。利用細胞黏著實驗、核磁共振、X光結晶學和分子嵌合模擬去研究整合蛋白與去整合蛋白之間結構和?能的關係。迄今，我們已經成?利用Rho設計出對整合蛋白具有親和力和專一性的抑制劑，包含了對整合蛋白?vβ3具有專一性的48ARLDDL突變株，和對整合蛋白?vβx和?5β1具有專一性的KG突變株。在我的研究中發現RGD的N端區域(殘基39-43)對於整合蛋白?vβ3、?IIbβ3和?5β1的結合扮演重要的角色。細胞黏著實驗顯示馬來腹蛇蛇毒蛋白突變株含有39KKKRT序列有最高的抑制效果，對整合蛋白?vβ3、?IIbβ3和?5β1分別有3 6、4 6和6 2倍的抑制效果提升。相對來說，Rho突變株含有46DD對於整合蛋白?vβ3、?IIbβ3和?5β1分別有7 2、124 5和>582 0倍的抑制效果下降。而RGD的C端區域突變株將54DD置換成54YY對於整合蛋白?vβ3和?5β1的抑制有2 7和3 8倍的提升。野生型Rho、KKKRT和R46E突變株的三維結構已經以X光結晶學解出。而結構的分析顯示，在KKKRT序列中的R42與C端區域的Y67和H68間有交互作用，且在野生型Rho的SRAGK序列沒有發現這樣的交互作用，而KKKRT突變株和整合蛋白嵌合模型中，也顯示R42是與整合蛋白β1和β3次單元中的D216交互作用，而這些作用也沒有在野生型Rho與整合蛋白的嵌合模型中發現。Rho野生型R46側鏈與R46E突變株的E46側鏈方向相反，且在嵌合模型中發現R46可與整合蛋白?IIb次單位的D159形成鹽橋，然而在R46E突變株中E46卻不能形成。這些結果顯示在去整合蛋白中RGD序列附近區域會去影響他們對於整合蛋白之間結合與交互作用。將GNGRG序列放入Rho中去研究其對於整合蛋白的結合，而質譜與核磁共振結果顯示，NGR會轉換成DGR和isoDGR異構物。在細胞黏著的實驗顯示兩個異構物對於整合蛋白?vβ3的IC50約為250 μM，而對於整合蛋白?5β1有較高的抑制能力，isoDGR異構物的IC50為4 5 μM，而isoDGR異構物相較於DGR異構物的抑制能力有6倍增加，且含有isoDGR序列的蛋白對於整合蛋白?5β1是一個較好的配體。流式細胞儀和西方墨點法結果顯示整合蛋白β3降低的A375細胞已經建立，而其黏著實驗顯示細胞無法黏著在纖維蛋白原(fibrinogen)上。細胞爬行實驗顯示Rho、RLD和ARLDDL可以抑制A375細胞的爬行其IC50分別為9 3，3 7和45 1 nM，相對來說Rho、RLD和ARLDDL對整合蛋白β3降低的A375細胞抑制能力為0 5，3 0和>100 μM。這些結果顯示對整合蛋白?vβ3專一性的突變株抑制人類的黑色素細胞瘤是取決於整合蛋白β3的路徑。我們發現Rho和其突變株可以有效抑制管柱形成、細胞爬行和生長，其IC50為5-50 nM。並且也發現可以抑制胰臟癌細胞(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1和Mia paca-2)的在vitronectin和fibronectin上的黏著。然而無法抑制黑色素細胞瘤A375細胞在fibronectin的黏著。而Rho和KG抑制胰臟癌和黑色素細胞瘤細胞爬行能力的IC50為40-250 nM。細胞存活實驗也顯示Rho和KG可以抑制細胞生長和藉由Akt/caspase-3途徑誘導細胞凋亡。異種移植動物模型也顯示KG可以抑制胰臟癌腫瘤的生長。這些研究結果可以提供對於癌症治療去設計高度專一性整合蛋白藥物提供一個新的觀點。

Date of Award	2015 Mar 19
Original language	Chinese
Supervisor	Woei-Jer Chuang (Supervisor)