利用基因育種的方法改善橙黃壺菌BL10的油脂品質

橙黃壺菌Aurantiochytrium strain BL10是一個富含22碳6烯酸 (docosahexaenoic acid, DHA) 的破囊壺菌品系，憑藉著容易培養、生長快速及高DHA產量的優點而得以進入商業量產，成為當今國內唯一一個用來製造DHA油脂商品的微生物品系。惟其在進行工業級量產的過程中，容易產生過多的棕梠酸，導致粗萃油脂的飽和度偏高，必須動用到昂貴的加工製程來移除部分棕梠酸，才有辦法達到上市標準。也因此，本研究的目的，在於嘗試利用基因育種的方法來解決前述問題。首先建構一個BL10的隨機插入致變株庫，搭配sulfo-phospho-vanillin method的高通量油脂分析法，從中篩出DHA含量偏高、然棕梠酸含量偏低的突變株後，利用LA PCR分析其基因體內DNA insert的franking sequence，搭配與BL10 genome database的比對分析，確認DNA insertion破壞的基因為何之後，以CRISPR/Cas9基因編輯法代替DNA insertion進行該基因的剔除，獲得脂肪酸組成獲得改善、同時能合法使用於商業用途的BL10改良株。另一方面也將嘗試以CRISPR/Cas9的方法，針對BL10的棕梠酸合成酵素基因：fatty acid synthase (FAS) gene的5′、3′UTR，以及coding regions中介於1694~3470 bp、3638~7464 bp、13233~16244 bp等不含重要功能區間的片段進行編輯，視其能否獲得棕梠酸含量偏低的致變株。最後也將以heteroduplex mobility assay的方法，確認前述改良株的DHA含量增加及棕梠酸含量降低的表型變化是否均肇因於CRISPR/Cas9對於標的基因的修改。