紫檀?抑制端粒?活性與蛋白表現而誘導細胞老化可作為新穎肺癌治療策略

  • 吳 珮瑄

學生論文: Master's Thesis

摘要

近年來,細胞老化被認為是一種腫瘤抑制機制,外來壓力、致癌基因、端粒的穩定度與藥物處理皆可能造成細胞老化。細胞老化能抵抗細胞在不同壓力刺激下所產生的癌化現象,並有效抑制腫瘤的生長與促進癌症治療效果,因此被認為是一個新穎的抗癌策略。現今已有利用細胞老化作為抗癌機制的合成化合物出現,而天然物也相繼被報導能透過細胞老化抑制癌細胞生長,並且具有低毒性與低副作用的優勢。本研究使用的紫檀?是白藜蘆醇的類似物,在2014年被報導是個有潛力的端粒?活性抑制劑。端粒?在癌細胞中有大量表現的情形,但在正常細胞表現量極低,因此可做為抗癌藥物的標靶。此外,抑制端粒?能造成細胞老化的現象。過去?多研究指出p53在細胞老化中扮演著著重要的角色,並且p53也被報導是端粒?轉錄的負調控因子。本研究利用兩株不同p53表現的人類非小細胞肺癌細胞株H460 (p53 wide type)與H1299 (p53 null)探討紫檀?是否會藉由抑制端粒?活性與蛋白表現誘導老化現象進而抑制肺癌細胞生長,並進一步加入H1299轉殖p53基因 (H1299-p53+)的細胞株探討端粒?抑制後造成的細胞老化機轉與p53的關係。在細胞實驗中,利用Trypan blue 試驗評估紫檀?對H460與H1299細胞生長的影響,配合流式細胞儀分析細胞週期分布,以聚落形成試驗 (colony formation assay)評估細胞生長停滯現象,利用顯微鏡與共軛焦顯微鏡觀察三株肺癌細胞 (H460、H1299、H1299-p53+)處理紫檀?後的形態變化、老化指標 (senescence associated β–galactosidase SA-β-gal)活性與異染色質點 (senescence associated heterochromatin foci SAHF)的形成。接著以彗星試驗 (comet assay)分析DNA斷裂現象與利用 Real-Time PCR分析紫檀?對端粒?活性的抑制效果。以西方墨點法分析細胞週期調控蛋白、端粒?與DNA損傷機制相關蛋白的表現,接著轉殖端粒?質體進入H460肺癌細胞中使其端粒?過度表現,評估端粒?過度表現之H460肺癌細胞處理紫檀?後,老化現象是否回復。實驗結果顯示紫檀?能降低H460與H1299細胞株的細胞存活率與生長速率,且隨著處理時間延長則產生死亡,其中H1299細胞株對紫檀?的敏感度較低。在細胞週期分析方面,經紫檀?處理後H460與H1299細胞株皆表現S phase停滯現象以及S期細胞素cyclin E、cyclin A、p53、p21與p27表現量上升,cdc25A表現量下降。聚落形成試驗顯示細胞生長不可回復的情形。細胞的型態也變肥大扁平且具有老化SA-β-gal活性以及老化相關異染色質點的形成,尤其以H460細胞株較明顯。H1299-p53+細胞株也發現細胞老化現象較p53缺乏型的H1299細胞株明顯,這顯示具正常?能的p53細胞容易被紫檀?誘發老化現象。此外,我們也在實驗中觀察到DNA斷裂現象與DNA損傷機制的參與。在端粒?活性分析中 H460、H1299與H1299-p53+細胞株的端粒?活性皆受到抑制,但端粒?蛋白表現則只有H460與H1299-p53+被明顯抑制,這表示p53可能會負調控端粒?的轉錄使其蛋白表現量下降,因此加強紫檀?對端粒?的抑制效果與誘導的老化現象。最後,在端粒?過度表現實驗中,發現使H460肺癌細胞株端粒?過度表現能夠減少紫檀?處理導致的細胞DNA損傷現象並減少老化SA-beta-gal的活性。綜合以上實驗結果,證實紫檀?能透過抑制端粒?活性與蛋白表現進而誘發人類非小細胞肺癌的細胞老化,達到抑制癌細胞生長的效果,而p53會抑制端粒?蛋白表現進而增強紫檀?誘導的細胞老化現象。
獎項日期2015 二月 13
原文???core.languages.zh_ZH???
監督員Ying-Jan Wang (Supervisor)

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