Development of 5-Aminolevulinic Acid Production in Escherichia coli by Expression Modular Design and Metabolic Regulation

摘要

5-胺基酮戊酸（5-ALA）是生物體中必需的代謝中間體，在農業和醫學領域也有極大用途，例如用作可生物降解的除草劑、殺蟲劑、農作物生長的促進因子及腫瘤診斷。5-ALA之酸鹽衍生化學品已被美國食品和藥物管理局（FDA）批准，用作疑似高度惡性神經膠質瘤的手術光學成像劑。 近年來，由於基因和代謝工程學的迅速發展，利用基改及代謝調控的微生物生產5-ALA逐漸成為兼具可行性及永續性之製程。本研究探討亞比多球型紅桿菌之ALA合成?（RsHemA）、非專一性之ALA輸送蛋白（RhtA）和GroE分子伴侶三者的表達系統模組。磷酸?哆醛（PLP）為ALA合成?（ALAS）的輔因子，通過表達基因pdxK和pdxY或直接添加於培養基中皆可提高ALA的產量。添加終濃度為30 ?M之PLP時，可將5-ALA濃度由1 35 g/L提升至2 44 g/L。然而，RsHemA的包涵體為5-ALA生產的障礙之一，透過DnaKJ和GroESL分子伴侶共表達以重新折疊不可溶的包涵體，結果顯示僅GroESL分子伴侶可以顯著解決ALAS包涵體的問題。在雙質體表達系統中，5-ALA進一步提高至3 46 g/L；而當groESL基因簇整合至基因組中，即使沒有明顯的GroE蛋白表達，5-ALA產量略提升至4 01 g/L。 基因敲除是將碳代謝流由其他分流導向目標產品之常用策略。在本研究討論了ldhA，pta，sucC和pck基因敲除對於5-ALA生產之影響。ldhA、pck或pta的敲除對於提高ALA產量較為有益，sucC之剔除則導致生長缺陷。另外結合多基因合一的質粒系統在個別pck、pta基因剔除菌株中，5-ALA產量提昇至5 11 g/L和5 23 g/L。 最後，本研究中構築了不含質體之RrGI整合菌株，達成無生物標記且穩定之細胞工廠。此菌株呈現了高穩定性且5-ALA濃度可達初始菌株Rsr之5 53倍。利用相對轉錄水平、代謝物分析及電子顯微鏡分析細胞形態，以期闡明無質體菌株之差異。根據牽涉於糖解路徑、TCA循環和重組表達基因之轉錄水平，發現RrGI整合菌株的轉錄水平相較於質體表達菌株低10倍，然而重組蛋白表達卻相似，意味著RrGI菌株中的能量消耗可能更少，故葡萄糖、甘氨酸及琥珀酸消耗量相似，也能轉化出高產量5-ALA；同時，RrGI整合菌株之細胞更完整。整體而言，整合菌株RrGI可以執行更具效率且穩定的5-ALA轉化，並節省轉錄能耗，從而達到7 47 g/L產量和0 588 g/L/h的生產率。整合菌株也呈現較佳的穩定性，高ALA產量更可達三代；相較之下，RsrG菌株即使加有抗生素仍無法提供穩定ALA生產。

獎項日期	2020
原文	English
監督員	I-Son Ng (Supervisor)