Development of CRISPR/Cas9 system in Chlorella species to enhance lipid accumulation

摘要

近年來，微藻的開發與應用備受矚目，可用於生產多種高價值產品，因此研究極具前景。這十年來，由於基因編輯技術的蓬勃發展，?多研究致力於使用這些新興的技術在微藻基因工程上，以提高其油脂、色素、蛋白質、活性物質等之產量。相較於ZFN及TALEN，CRISPR/Cas9系統擁有高編輯效率、易於操作、低成本，且可以同時進行多組基因編輯的?能，因而被廣泛運用在微藻之相關研究。 本研究第一部分為找出最適合小球藻的電穿轉植載體，嘗試幾次使用衣藻適用之質體於小球藻的電穿轉植失敗後，我們證明使用來自農桿菌帶有左右同源臂 (Left and right border) 及綠色螢光蛋白的質體，在電壓360 V、電容25 ?F及電阻200 ohm下，能夠增加小球藻的電穿轉化效率。透過分光光度計與倒立螢光顯微鏡之觀測，在Chlorella vulgaris中有兩株綠色螢光表達量高於原藻（28%與67%）；而在Chlorella sorokiniana中則有三株（46%、58%與62%）。 接下來我們將CRISPR/Cas9系統分別應用到Chlorella vulgaris Chlorella sorokiniana與Chlorella variabilis NC64A。在C vulgaris中，以帶有左右同源臂的載體pHSE401輔以CRISPR技術干擾fad3基因，使油脂產量較原藻提升高達40%。另外在C variabilis的研究中，其全基因定序信息完整，能成?獲得PEPC基因，唯其電穿後修復能力不佳，導致後續研究無法進行。目前多數微藻由於基因組訊息尚不完整但藻體本身富涵高GC含量，故設計具有大量鳥糞嘌呤鹼基的sgRNA，命名為輔助調適基因調控 (ASGARD)，分別搭配CRISPRi與CRISPRa系統送入C sorokiniana中，並針對其生物量、油脂以及蛋白產量分析觀察。雖然轉植藻株之生物量與油脂產量與野生型相比並無明顯差異性，其蛋白產量卻有顯著增加，並可提升超過60%，說明目前開發技術具有顯著的潛力。

獎項日期	2019
原文	English
監督員	I-Son Ng (Supervisor)