Establishment of Screening Platform and Direct Evolution of Recombinant Carbonic Anhydrase in E coli

摘要

碳酸酐? ( Carbonic Anhydrase CA ) 廣泛存在於大自然的各種生物中，是一種以鋅離子結合在活性中心的酵素，能夠催化二氧化碳與水反應形成碳酸氫根離子。本研究其初選用來自Sulfurihydrogenibium yellowstonense YO3AOP1的CA (簡稱 SyCA)，在大腸桿菌中進行異源表達、比較不同質體的酵素活性，同時建立了Arduino-pH tracker (ART) 硬體系統，應用於 SyCA 酵素的動力學及特性分析。接者以此數據為基礎，進行活性高但耐熱性不足的 MlCA 及表達量佳但活性及穩定性不足的 hCAII 的定向進化實驗，期待打造出具耐熱性、高穩定性、高活性的碳酸酐?，且應用於工業的二氧化碳封存製程中。 實驗結果顯示，透過pET28a及pET32a 生產的 SyCA 粗蛋白活性分別為 20558 WAU/mg及22773 WAU/mg，在80 oC加熱 100 分鐘後，粗蛋白殘餘活性為 37 47 %，全細胞殘餘活性為 79 91%。SyCA 在pH 4 的環境下活性最好，在 9 種不同的金屬離子的環境中 ( 包含 IA、IIA，及過度金屬 ) 進行試驗，發現 Cu2+ 以及 Zn2+ 會大幅度降低 SyCA 活性。由 ART 系統分析 SyCA 粗蛋白，獲得kcat 及 kcat/KM 為 5 98 x106 s-1 和 37 9x107 s-1 M-1，全細胞則為 3 37 x106 s-1 和 8 62x107 s-1 M-1。 在定向進化的篩選實驗中，架設了兩套不同的篩選平台，分別是酚紅指示劑篩選平台及菌落尺度篩選，以利用於定向進化突變後的篩選實驗。而在突變實驗中，設計了3種不同的突變策略：(一) 電腦設計的雙硫鍵添加技術，(二) 隨機突變的RECODE，及 (三) 易錯 (error-prone) PCR ( 即 EP-PCR ) 技術。在 EP-PCR 突變實驗中，成?的生產超過 1400 個單菌落，挑選其中 576 個單菌落進行篩選實驗，完成突變技術展示及 CA 定向進化篩選平台成效的驗證。

獎項日期	2019
原文	English
監督員	I-Son Ng (Supervisor)